Современные молекулярно-генетические технологии в диагностике вирусных заболеваний

Известно, что коронавирусы (CoV) — это одноцепочечные РНК-содержащие вирусы, относящиеся к подсемейству Coronavirinae, семейству Coronaviridae, отряду Nidovirales. CoV легко мутируют, что дает им возможность быстро адаптироваться к новым условиям . Эволюция возбудителя была не только следствием филогении, но и результатом взаимодействия между вирусом и хозяином . До эпидемии атипичной пневмонии было известно около 10 CoV с полными последовательностями генома, разделенные на три группы, но в 2011 г. Международным комитетом по таксономии вирусов группы переименовали в три рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus и Gammacoronavirus. Филогенетический анализ генома SARS-CoV определил уникальное положение в роде β-коронавирусов, который впоследствии был помещен в подрод Sarbecovirus. Типичные представители β-коронавирусов (например, вирус гепатита мыши, CoV OC43 человека, CoV крупного рогатого скота) были классифицированы как Embecovirus. После эпидемии SARS было обнаружено беспрецедентное количество новых CoV. Это привело к описанию линии C Betacoronavirus, которая включает коронавирусы летучих мышей (Tylonycteris HKU4, Pipistrellus HKU5, Hypsugo HKU25) и вирус, вызывающий ближневосточный респираторный синдром CoV , а также линии D Betacoronavirus и новый род Deltacoronavirus . Затем линия C и линия D Betacoronavirus были переименованы в подроды Merbecovirus и Nobecovirus.

На сегодняшний день установлено, что 7 видов CoV передаются от человека к человеку. Среди них HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43 и HCoV-229E, вызывающие заболевания верхних дыхательных путей . С 1960-х годов были хорошо известны HCoV-OC43 и HCoV-229E. Впоследствии SARS-CoV, HCoV-NL63 и HCoV-HKU1 детектировались в 2003, 2004 и 2005 гг. соответственно . MERS-CoV, выделенный в 2012 г., аналогичен SARS-CoV. Вирусы MERS-CoV и SARS-CoV поражают в большей степени нижние дыхательные пути и потенциально могут вызвать острый респираторный синдром. В декабре 2019 г. в Китае выявлена новая коронавирусная инфекция у пациентов с пневмонией . 7 января 2020 г. ВОЗ представила данный коронавирус как 2019-nCoV, позднее вирус был переименован в SARS-CoV-2 . Заболевание сопровождается поражением, прежде всего, легочной ткани и, как правило, у лиц пожилого возраста и с сопутствующими заболеваниями с тяжелым течением, что приводит к полиорганной недостаточности, острому респираторному дистресс-синдрому, поражению желудочно-кишечного тракта и пневмонии . По состоянию на январь 2021 г. количество заболевших COVID-19 по всему миру достигло 92,3 млн человек, летальных исходов — 1,97 млн. Количество проводимых тестов на выявление SARS-CoV-2 в России существенно возросло с начала 2020 г. На июнь 2021 г. проведено более 100 млн тестов на выявление новой коронавирусной инфекции.

Диагностика вирусных заболеваний

Высокая контагиозность и стремительное распространение вирусных инфекций обусловливают важность своевременной постановки точного клинического диагноза заболевания. На сегодняшний день существует необходимость получать данные о происхождении, путях распространения и эволюции возбудителей для дальнейшего прогнозирования и предупреждения заболевания . Благодаря внедрению передовых молекулярно-генетических методов это стало возможным . С целью создания доступных, точных и быстрых методов для выявления SARS-CoV-2 лабораториями по всему миру успешно разрабатываются и производятся крайне необходимые тестовые наборы для скринингового выявления инфекции, т. к. именно бессимптомные случаи способствуют ее дальнейшему распространению.

Современные коммерчески доступные тесты на COVID-19 основаны на молекулярных анализах для обнаружения вирусной РНК SARS-CoV-2 с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации нуклеиновых кислот. Методы молекулярной диагностики, основным критерием эффективности которых является высокая чувствительность, позволяют избежать ложноотрицательных результатов и используются для постановки диагноза, а также для выявления бессимптомных форм и носительства SARS-CoV-2. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) считается «золотым стандартом» для идентификации вируса SARS-CoV-2 . ОТ-ПЦР основана на способности амплифицировать небольшое количество генетического вирусного материала в образце. В качестве стандартного исследуемого материала используют мазки, взятые из верхних дыхательных путей. Кроме того, было проведено несколько исследований с использованием сыворотки крови, кала, слезной жидкости и слюны. ОТ-ПЦР начинается с преобразования вирусной геномной РНК в ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). В этой реакции используются праймеры (синтетические олигонуклеотиды) для последовательностей ДНК, предназначенные для специфического распознавания комплементарных последовательностей в вирусном геноме РНК и обратной транскриптазы с целью создания короткой комплементарной ДНК-копии (кДНК) вирусной РНК. В ОТ-ПЦР амплификация ДНК отслеживается в реальном времени по мере развития реакции с использованием флуоресцентного красителя или ДНК-зонда, специфичного для последовательности, меченного флуоресцентной молекулой и молекулой гасителя . ОТ-ПЦР проводится как одно- и как двухэтапная процедура. В одноэтапной ОТ-ПЦР в реальном времени используется одна пробирка, содержащая необходимые праймеры для проведения всей реакции ОТ-ПЦР. Двухэтапная ОТ-ПЦР в реальном времени включает более одной пробирки для проведения отдельных реакций обратной транскрипции и амплификации, но обеспечивает более высокую чувствительность и требует меньшего исходного материала, чем одноэтапная процедура, а также позволяет хранить кДНК для количественной оценки нескольких мишеней. Несмотря на это, одноэтапная процедура является предпочтительным методом для обнаружения SARS-CoV-2 благодаря сокращению времени на лабораторное тестирование, что снижает вероятность ошибок при дозировании и контаминации на этапах ПЦР в реальном времени.

В большинстве молекулярных диагностических тестов используется технология ОТ-ПЦР в реальном времени, нацеленная на различные области генома SARS-CoV-2, включая области ORF1b или ORF8, а также нуклеокапсид (N), белок-шип (S), РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRP) или гены оболочки (E) . Тесты ОТ-ПЦР постоянно совершенствуются и автоматизируются. Например, в тесте ePlex SARS-CoV-2, разработанном GenMark Diagnostics, Inc., для обнаружения SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки используется прибор ePlex. Каждый тестовый картридж содержит реагенты для магнитной твердофазной экстракции вирусной РНК, амплификации кДНК и детекции, сочетающие электросмачивание и технологию GenMark eSensor. ДНК-мишень смешивается с сигнальными зондами, меченными ферроценом, комплементарными конкретным мишеням. Целевая ДНК гибридизируется с сигнальным и захватывающим зондами, которые связаны с позолоченными электродами. Присутствие мишени определяется с помощью вольтамперометрии, которая генерирует определенные электрические сигналы от сигнального зонда.

Несмотря на широкое применение ОТ-ПЦР для детекции SARS-CoV-2, метод имеет ряд ограничений: длительность анализа, необходимость наличия дорогостоящего лабораторного оборудования и высококвалифицированного персонала. В связи с этим существует необходимость совершенствования этого метода и разработки других методов идентификации. Одним из таких альтернативных методов является изотермическая амплификация нуклеиновых кислот. В отличие от метода ОТ-ПЦР, требующего многократных изменений температуры для каждого цикла с использованием сложного оборудования для термоциклирования , изотермическая амплификация проводится при постоянной температуре, таким образом, устраняется необходимость в термоциклере. Изотермическая амплификация, опосредованная обратной транскрипцией (RT-LAMP), является быстрым и экономически выгодным методом для тестирования на SARS-CoV-2. Для RT-LAMP требуется набор из четырех праймеров, специфичных для целевого гена/области, что повышает чувствительность теста, и сочетает LAMP с этапом обратной транскрипции для обнаружения РНК. Продукт амплификации может быть обнаружен с помощью фотометрии, измерения мутности, вызванной осадком пирофосфата магния в растворе в качестве побочного продукта амплификации. За реакцией также можно следить в реальном времени путем измерения флуоресценции с использованием интеркалирующих красителей. Поскольку для диагностического тестирования RT-LAMP в реальном времени требуется только нагревание и визуальный осмотр, его простота и чувствительность делают его многообещающим методом для обнаружения вирусов. Некоторые из доступных в настоящее время молекулярных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 используют технологию RT-LAMP в реальном времени, например тест ID NOW COVID-19 от Abbott Diagnostics. Этот тест можно проводить у постели больного, он является быстрым (≤13 мин) и используется для обнаружения вирусной РНК SARS-CoV-2 в мазках из верхних дыхательных путей, но ограничен использованием только одного образца за цикл. Тест RT-LAMP, разработанный Zhang et al., основан на применении обратной транскриптазы (WarmStart RTx от BioLabs) для преобразования вирусной РНК в кДНК, которая впоследствии амплифицируется ДНК-полимеразой (Bst2.0 Warmstart), для колориметрического обнаружения с помощью ДНК-связывающего красителя (SYTO-9, ThermoFisher). Фермент представляет собой уникальную in silico РНК-направленную ДНК-полимеразу, связанную с обратимо связанным аптамером, который ингибирует активность RTx при температуре ниже 40°C. Было показано, что колориметрический LAMP эффективен при обнаружении вирусной РНК в клеточных лизатах на уровне примерно 480 копий РНК, обеспечивая альтернативу ОТ-ПЦР для быстрого и простого обнаружения РНК SARS-CoV-2.

Современные молекулярно-генетические тесты

К числу внедряемых в практику молекулярно-генетических методов относится опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА), являющаяся запатентованной технологией изотермической амплификации с одной пробиркой. ТМА смоделирована на основе репликации ретровирусов, которую можно использовать для амплификации определенных участков РНК или ДНК, и имеет более высокую чувствительность, чем ОТ-ПЦР. В методе используют обратную транскриптазу и РНК-полимеразу Т7. На основе данного метода разработана платформа Hologic Panther Fusion, на которой возможно проводить как ОТ-ПЦР, так и ТМА; она отличается высокой пропускной способностью (до 1000 тестов за 24 ч) и возможностью одновременного скрининга на другие распространенные респираторные вирусы, клинически схожие с COVID-19. На начальной стадии происходит гибридизация вирусной РНК-мишени со специфическим улавливающим зондом и дополнительным олигонуклеотидом, содержащим промоторный праймер Т7, которые захватываются магнитными микрочастицами при воздействии магнитного поля. Затем захваченная РНК-мишень, гибридизованная с праймером промотора Т7, подвергается обратной транскрипции в комплементарную кДНК. Активность РНКазы H обратной транскриптазы впоследствии приводит к разрушению цепи РНК-мишени из гибридного дуплекса РНК-кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК, которая включает промотор Т7. Дополнительный праймер используется для создания двухцепочечной ДНК, которая транскрибируется в РНК-ампликоны с помощью РНК-полимеразы Т7. Эти новые ампликоны РНК затем повторно входят в процесс ТМА, что способствует экспоненциальной амплификации генерировать миллиарды ампликонов РНК менее чем за 1 ч.

Анализы на основе CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками) также активно внедряются в диагностику вирусных заболеваний. CRISPR представляют собой семейство последовательностей нуклеиновых кислот, обнаруженных в прокариотических организмах. Эти последовательности могут быть распознаны и разрезаны набором бактериальных ферментов, называемых CRISPR-ассоциированными ферментами, примером которых являются Cas9, Cas12 и Cas13. Некоторые ферменты семейств Cas12 и Cas13 запрограммированы для нацеливания и разрезания вирусных последовательностей РНК. На сегодняшний день две компании — Mammoth Biosciences и Sherlock Biosciences — независимо друг от друга изучают возможность использования методологии редактирования генов CRISPR для обнаружения SARS-CoV-2. Метод SHERLOCK, разработанный Sherlock Biosciences, использует Cas13, который способен разрезать последовательности репортерной РНК в ответ на активацию направляющей РНК, специфичной для SARS-CoV-2. Анализ DETECTR, разработанный Mammoth Biosciences, основан на расщеплении репортерной РНК с помощью Cas12a для специфического обнаружения вирусных последовательностей РНК генов E и N с последующей изотермической амплификацией мишени, приводящей к визуальному считыванию с помощью флуорофора. Эти основанные на CRISPR методы не требуют сложной аппаратуры, проводятся быстро (анализ занимает не более 1 ч) и являются экономически выгодными. Результаты могут визуализироваться с помощью бумажных полосок, не происходит снижения чувствительности и специфичности.

Альтернативный метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, известный как амплификация по типу катящегося кольца (RCA), привлек значительное внимание как метод обнаружения нуклеиновых кислот, поскольку в изотермических условиях происходит 109-кратное усиление сигнала каждого круга в течение 90 мин. RCA выгодна тем, что ее можно проводить с минимальным количеством реагентов, она позволяет избежать получения ложноположительных результатов, часто встречающихся в анализах на основе ПЦР. Для быстрого обнаружения вирусных нуклеиновых кислот используют высокопроизводительные тесты на микрочипах, основанные на генерации кДНК из вирусной РНК с использованием обратной транскрипции и последующего мечения кДНК специфическими зондами. Меченые кДНК загружают в лунки лотков для микрочипов, содержащих твердофазные олигонуклеотиды, закрепленные на их поверхности]. Анализ на микроматрицах способствует выявлению мутаций, связанных с SARS-CoV, используется для обнаружения до 24 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), связанных с мутациями в гене spike (S) SARS-CoV, с 100% точностью. Способность обнаруживать различные появляющиеся штаммы SARS-CoV-2 может стать очень востребованной по мере развития пандемии COVID-19, а анализы на микроматрицах обеспечивают платформу для быстрого обнаружения новых штаммов в результате мутационной изменчивости. Одним из недостатков тестирования на микроматрицах была его высокая стоимость, однако позднее был разработан более дешевый нефлуоресцентный тест, содержащий набор олигонуклеотидов с низкой плотностью, для обнаружения нескольких штаммов коронавируса . Кроме того, портативная диагностическая платформа на основе микроматричного чипа использовалась и для идентификации нуклеиновых кислот, специфичных для коронавируса MERS, а также для вирусов гриппа и др.

Наиболее прогрессивным методом идентификации вирусов является метагеномное секвенирование ампликонов. Диагностическое тестирование, основанное на секвенировании вирусного генома, — важный инструмент для определения скорости и степени мутационной изменчивости, связанной с SARS-CoV-2, и для выявления вновь появляющихся штаммов вируса с целью более эффективной разработки вакцины. Метод основан на двойном подходе, включающем использование секвенирования ампликонов в дополнение к метагеномному секвенированию. Метагеномное секвенирование используется в первую очередь для устранения фонового микробиома в образцах от инфицированных людей. Это позволяет быстро идентифицировать как вирус SARS-CoV-2, так и другие патогены, приводящие к развитию вторичных инфекций, влияющих на тяжесть протекания COVID-19. Секвенирование SARS-CoV-2 и других вирусов на основе ампликонов позволяет отслеживать молекулярную эпидемиологию и эволюцию возбудителей. Метагеномные подходы, такие как SISPA (не зависимая от последовательности амплификация с одним праймером), обеспечивают дополнительный анализ расхождения последовательностей. Этот двойной метод особенно актуален для SARS-CoV-2 при оценке скорости его мутации и обнаружении возможной рекомбинации с другими коронавирусами, что имеет значение для разработки вакцин и оценки эффективности противовирусной терапии. В своем исследовании Moore et al. (2020) использовали секвенирование на основе ампликона и метагеномного секвенирования MinION для быстрого (в течение 8 ч) секвенирования генома SARS-CoV-2 и другого микробиома в мазках из носоглотки, полученных от пациентов с COVID-19. При этом были определены 16 сайтов связывания праймеров из консервативных областей в геноме SARS-CoV-2 для последовательной амплификации фрагментов размером примерно 1000 пар нуклеотидов (п.н.) с перекрывающейся областью примерно 200 п.н. Эти наборы праймеров затем использовали для создания 30 ампликонов из кДНК, которые впоследствии секвенировали с помощью MinION.

Компания Illumina, Inc. (NASDAQ: ILMN) разработала платформу для метагеномного секвенирования нового поколения, позволяющую не только обнаруживать наличие нескольких штаммов коронавирусов, но и всесторонне изучать другие патогенные организмы, присутствующие в образце. Исследование включает в себя подготовку образцов с помощью набора для истощения рРНК TruSeq Ribo-Zero Gold, подготовку библиотеки с использованием полной цепочечной РНК TruSeq, секвенирование с применением настольной системы секвенирования Illumina и окончательный анализ данных с помощью модуля LRM Resequencing или платформы IDbyDNA Explify

Заключение

За последний год активная разработка наборов для диагностики вирусных инфекций способствовала совершенствованию молекулярно-генетических методов, особенно для тестирования в местах оказания помощи, при массовых и скрининговых исследованиях. Метод ОТ-ПЦР активно применяется во всем мире при детекции вирусной РНК, тогда как другие исследования нуклеиновых кислот, такие как изотермическая ПЦР, анализы на гибридизационных микрочипах, метагеномическое секвенирование на основе ампликонов и передовые технологии, связанные с CRISPR, все еще находятся на стадии внедрения в клиническую практику. На сегодняшний день сверхбыстрые тест-наборы и тесты в местах оказания медицинской помощи являются основным направлением разработок, что ускорит постановку диагноза и, соответственно, обеспечит своевременное лечение, снизит процент вторичных инфекций и развития осложнений.